NFS1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403102-ACT

NFS1 umano codifica una desulfurasi della cisteina che mobilizza lo zolfo dalla L-cisteina per supportare la biogenesi dei cluster ferro–zolfo (Fe–S) nei mitocondri, agendo insieme a proteine partner nel macchinario centrale di assemblaggio. Consentendo la maturazione degli enzimi dipendenti dai Fe–S, NFS1 influenza la fosforilazione ossidativa, il metabolismo mitocondriale dipendente dall’acido lipoico e l’omeostasi redox, con effetti a valle sulla replicazione/riparazione del DNA e sulle risposte cellulari allo stress. L’alterazione dell’assemblaggio dei cluster Fe–S può compromettere la funzione della catena respiratoria e l’attività degli enzimi metabolici, collegando le vie regolate da NFS1 alla disfunzione mitocondriale e a fenotipi di instabilità genomica studiati in diversi contesti rilevanti per le malattie. In quanto nodo centrale nella biosintesi dei cofattori mitocondriali, NFS1 è frequentemente indagato in modelli di vulnerabilità metabolica, stress ossidativo e stati proliferativi alterati.

NFS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NFS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NFS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NFS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NFS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NFS1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NFS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NFS1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NFS1 nelle cellule tumorali con espressione di NFS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.