MUS81 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402664-ACT

O MUS81 humano codifica uma endonuclease específica de estrutura que forma complexo com EME1/EME2 para resolver forquilhas de replicação estagnadas e intermediários de recombinação, incluindo junções de Holliday com “nick”, D-loops e flaps 3′. O MUS81 atua em redes de resposta a danos no DNA e mantém a estabilidade do genoma por meio de ação coordenada com a recombinação homóloga, o reparo associado à anemia de Fanconi e vias de tolerância ao estresse replicativo. Ao controlar o processamento de estruturas de DNA aberrantes, o MUS81 influencia a sinalização de checkpoints e a fidelidade da segregação cromossômica durante a fase S e a mitose. A desregulação da atividade do MUS81 ou do equilíbrio dessas vias tem sido associada a alterações no manejo do estresse replicativo e a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e para defeitos hereditários de reparo do DNA.

MUS81 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MUS81 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MUS81 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MUS81 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MUS81, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MUS81. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MUS81 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MUS81 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MUS81 em células tumorais com expressão de MUS81 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.