MuRF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400797-ACT

TRIM63 codifica MuRF1, una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio RING-finger специфica del muscolo, che promuove il turnover proteasomiale selettivo di proteine sarcomeriche e miofibrillari durante il rimodellamento del muscolo scheletrico e cardiaco. MuRF1 integra l’attività del sistema ubiquitina–proteasoma con la segnalazione responsiva allo stress, inclusi programmi trascrizionali dipendenti da FOXO e vie cataboliche che regolano l’omeostasi proteica e la funzione contrattile. Un’alterata espressione di TRIM63/MuRF1 è associata a fenotipi di atrofia muscolare e a processi di rimodellamento osservati in contesti di malattia cronica e di disuso, ed è frequentemente studiata come effettore molecolare dello squilibrio della proteostasi. In quanto regolatore della stabilità delle miofibrille, MuRF1 fornisce un appiglio meccanicistico per indagare le vie che collegano stress metabolico, infiammazione e adattamento strutturale del muscolo.

MuRF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM63 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MuRF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM63 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM63, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MuRF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM63 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MuRF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MuRF1 nelle cellule tumorali con espressione di TRIM63 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.