mtTFA CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423355-ACT

Tfam kodiert den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (mtTFA), ein High-Mobility-Group-Protein, das an mitochondriale DNA bindet, um Nukleoide zu verpacken und die Transkription und Replikation des mitochondrialen Genoms zu regulieren. mtTFA ist ein zentraler Determinant der mtDNA-Kopienzahl und der mitochondrialen Genexpression und beeinflusst dadurch die oxidative Phosphorylierung, die ATP-Produktion und die Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies. Über diese Funktionen ist es in Programme der mitochondrialen Biogenese sowie in Signalwege der nukleär–mitochondrialen Kommunikation eingebunden, die den Zellstoffwechsel und Stressantworten prägen. Veränderte TFAM-Aktivität und die Aufrechterhaltung der mtDNA werden häufig in Modellen neuromuskulärer Dysfunktion, Neurodegeneration, kardiometabolischer Phänotypen und durch mitochondriale Stresssignale getriebener Entzündung untersucht.

mtTFA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tfam-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mtTFA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tfam-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tfam-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mtTFA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tfam-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mtTFA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mtTFA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tfam-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.