MIB1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404769-ACT

Il gene umano **MIB1** codifica per **mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1**, una ligasi E3 dell’ubiquitina che promuove l’ubiquitinazione e l’endocitosi dei ligandi di Notch, come **JAG1** e le proteine **DLL**, consentendo così un’attivazione produttiva del recettore Notch. Attraverso la regolazione del traffico dei ligandi e della competenza di segnalazione recettore–ligando, MIB1 influenza le decisioni sul destino cellulare, la differenziazione e la strutturazione dei tessuti in contesti di sviluppo e di omeostasi. L’attività di MIB1 interagisce con la proteostasi dipendente dall’ubiquitina e con le vie di smistamento endocitico, plasmando gli output trascrizionali a valle della segnalazione Notch. La disregolazione dell’asse MIB1/Notch è stata associata ad alterazioni della neurogenesi, a fenotipi dello sviluppo cardiovascolare e a stati di segnalazione oncogenica, stimolando studi meccanicistici in diversi modelli cellulari.

MIB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MIB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MIB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MIB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MIB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MIB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MIB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MIB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MIB1 nelle cellule tumorali con espressione di MIB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.