Plásmido CRISPR de Activación (m) METTL3: sc-425096-ACT

Mettl3 codifica METTL3, el núcleo catalítico del complejo metiltransferasa de ARN N6‑metiladenosina (m6A) que deposita marcas m6A en el ARNm y otros ARN para regular el empalme (splicing), la exportación nuclear, la eficiencia de traducción y la estabilidad del ARN. Mediante la coordinación con cofactores como METTL14 y WTAP, así como con los lectores y las “erasas” (enzimas desmetilantes) de m6A aguas abajo, METTL3 influye en programas de expresión génica que controlan la progresión del ciclo celular, la diferenciación y las respuestas al estrés. En sistemas murinos, la alteración de la actividad de METTL3 se ha vinculado a cambios en las decisiones de destino de células hematopoyéticas e inmunitarias, procesos del neurodesarrollo y la regulación metabólica, lo que refleja su amplio impacto en las vías de procesamiento del ARN. La señalización m6A desregulada también se asocia con estados transcripcionales oncogénicos e inflamatorios, lo que convierte a Mettl3 en un nodo ampliamente utilizado para estudiar el control epitranscriptómico de fenotipos relevantes para la enfermedad.

METTL3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Mettl3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

METTL3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Mettl3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Mettl3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de METTL3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Mettl3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de METTL3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía METTL3 en células tumorales con expresión de Mettl3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.