MECL-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402101-ACT

PSMB10 codifica a MECL-1, uma subunidade β induzível do imunoproteassoma que substitui componentes constitutivos do proteassoma em resposta a sinais inflamatórios, como o interferon-γ. A MECL-1 contribui para a degradação de proteínas dependente de ubiquitina e molda o processamento de antígenos do MHC classe I ao influenciar a geração de epítopos peptídicos apresentados a células T CD8+. Por meio do seu papel na proteostase e na vigilância imunológica, alterações na composição do imunoproteassoma podem afetar a sinalização inflamatória, a dinâmica da apresentação de antígenos e as respostas ao estresse celular. A desregulação de subunidades do imunoproteassoma, incluindo a MECL-1, tem sido associada a patologias mediadas pelo sistema imune e a mecanismos de evasão imune relacionados ao câncer em contextos de pesquisa translacional.

MECL-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PSMB10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MECL-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PSMB10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PSMB10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MECL-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PSMB10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MECL-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MECL-1 em células tumorais com expressão de PSMB10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.