MAMDC4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-414780-ACT

Il gene umano MAMDC4 (MAM domain containing 4) codifica una proteina associata alla membrana, caratterizzata da domini MAM implicati nelle interazioni cellula–cellula e cellula–matrice. L’espressione di MAMDC4 è stata collegata alla differenziazione epiteliale e a processi associati alla polarità, in linea con un ruolo nell’organizzazione di reti di segnalazione e adesione prossimali alla membrana. Livelli deregolati di MAMDC4 sono stati riportati in diversi contesti patologici, inclusi programmi trascrizionali associati al cancro, rendendolo rilevante per lo studio di come stati epiteliali alterati influenzino proliferazione, migrazione e organizzazione tissutale. In quanto fattore di superficie e vicino alle giunzioni, MAMDC4 è spesso analizzato in modelli di biologia delle barriere e di plasticità fenotipica delle cellule tumorali.

MAMDC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAMDC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAMDC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAMDC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAMDC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAMDC4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAMDC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAMDC4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAMDC4 nelle cellule tumorali con espressione di MAMDC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.