M33 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402604-ACT

CBX2 codifica la proteina del gruppo Polycomb M33, un componente della famiglia chromobox del complesso repressivo Polycomb canonico 1 (PRC1), che riconosce H3K27me3 e contribuisce al mantenimento del silenziamento trascrizionale attraverso la compattazione della cromatina e l’ubiquitinazione dell’istone H2A. Imponendo programmi stabili di repressione epigenetica, CBX2 contribuisce alla specificazione del destino cellulare, al controllo dei geni dello sviluppo e alla regolazione delle reti trascrizionali associate alla proliferazione. Un’espressione deregolata di CBX2 o un’alterazione dell’attività di PRC1 è collegata a stati di differenziamento modificati e a programmi trascrizionali oncogeni in molteplici contesti tumorali, rendendolo un nodo utile per studiare i meccanismi epigenetici della regolazione genica rilevante per la malattia. CBX2/M33 interagisce inoltre con vie più ampie di regolazione della cromatina coordinate dalla metilazione di H3K27 mediata da PRC2 e da altri “reader” e “writer” di modificazioni istoniche.

M33 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CBX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

M33 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CBX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CBX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di M33. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CBX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da M33 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via M33 nelle cellule tumorali con espressione di CBX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.