LPAAT-β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405045-ACT

AGPAT2 codifica a aciltransferase beta do ácido lisofosfatídico (LPAAT-β), uma enzima associada ao retículo endoplasmático que catalisa a acilação do ácido lisofosfatídico para formar ácido fosfatídico, um intermediário-chave na biossíntese de glicerofosfolipídios e triacilgliceróis. Ao controlar a disponibilidade de ácido fosfatídico, a LPAAT-β influencia a biogênese de membranas, a formação de gotículas lipídicas e processos de sinalização mediados por lipídios que se cruzam com o estresse metabólico e a homeostase de organelas. A atividade de AGPAT2 está intimamente ligada ao armazenamento de lipídios em adipócitos e ao equilíbrio energético sistêmico, e variantes com perda de função estão associadas à lipodistrofia generalizada congênita e a grave desregulação metabólica. Essas características fazem de AGPAT2 um alvo relevante para o estudo do remodelamento lipídico, da adipogênese e de perturbações, associadas a doenças, no metabolismo de fosfolipídios.

LPAAT-β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AGPAT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LPAAT-β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AGPAT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AGPAT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LPAAT-β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AGPAT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LPAAT-β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LPAAT-β em células tumorais com expressão de AGPAT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.