LGR5 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420320-LAC

Il gene murino Lgr5 codifica LGR5, un recettore accoppiato a proteine G contenente ripetizioni ricche in leucina, noto soprattutto come marcatore e regolatore funzionale delle popolazioni di cellule staminali adulte in molteplici tessuti epiteliali. LGR5 potenzia la segnalazione canonica Wnt/β-catenina grazie al legame ad alta affinità con i ligandi R-spondina, stabilizzando i complessi recettoriali Frizzled/LRP e amplificando i programmi trascrizionali che governano autorinnovamento, proliferazione e impegno di linea. Le cellule che esprimono Lgr5 contribuiscono all’omeostasi e alla rigenerazione tissutale, e l’attività alterata dell’asse LGR5/Wnt è ampiamente studiata in contesti di “stemness” deregolata, rimodellamento epiteliale e biologia tumorale. Di conseguenza, Lgr5 rappresenta un punto di accesso pratico per indagare la dinamica delle cellule staminali, la segnalazione della nicchia e le reti trascrizionali guidate da Wnt nei modelli murini.

Le particelle di attivazione lentivirale LGR5 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Lgr5 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale LGR5 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Lgr5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di LGR5. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Lgr5 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.