KIR7.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403910-ACT

KCNJ13 codifica il canale del potassio a rettificazione entrante KIR7.1, un regolatore chiave del potenziale di membrana e dell’omeostasi del K+ negli epiteli polarizzati e nei tessuti eccitabili. Modellando la conduttanza al potassio, KIR7.1 influenza il trasporto accoppiato agli ioni, la fisiologia della barriera epiteliale e i processi di segnalazione elettrica che si intersecano con il movimento transepiteliale dei fluidi e la funzione dell’epitelio pigmentato retinico. Alterazioni dell’attività di KCNJ13 sono state associate a disfunzioni retiniche e a fenotipi di patologie oculari ereditarie, a testimonianza del ruolo del canale nel mantenimento dell’equilibrio ionico nelle vie visive. In quanto canale di membrana con espressione specifica di tessuto, KIR7.1 rappresenta un nodo accessibile per analizzare come il flusso di potassio moduli l’eccitabilità cellulare, le reti di trasporto e le risposte allo stress.

KIR7.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR7.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR7.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR7.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR7.1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.