KIR3.4 Double Nickaseプラスミド (h): sc-404643-NIC

ヒトのKCNJ5は、内向き整流性カリウムチャネルサブユニットであるKIR3.4（GIRK4）をコードしており、他のGIRKファミリー分子と会合して、GPCRシグナル伝達を膜の過分極へと結び付けるGタンパク質制御性K+チャネルを形成します。Gβγサブユニットの制御下でカリウムを伝導することにより、KIR3.4は細胞興奮性、ペースメーカー活動、ならびにカルシウム流入と下流シグナル伝達を形作る刺激依存的な膜電位変化の調節に寄与します。KCNJ5は副腎球状層細胞におけるアルドステロン調節に関与するとされ、反復して見られる変異は、鉱質コルチコイド過剰に関連する疾患や、それに伴う心代謝系表現型と関連付けられています。KIR3.4機能の変化は、GPCR経路の調節やイオン恒常性を含む、心臓および神経内分泌シグナルの電気生理学的研究においても重要です。

KIR3.4 ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における KCNJ5 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、KCNJ5内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、KCNJ5の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、KCNJ5が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。