Kinectin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404296-ACT

Das menschliche KTN1 kodiert Kinectin 1, einen mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) assoziierten Rezeptor für Kinesin, der dazu beiträgt, mikrotubuli-basierten Transport mit der Organisation und Dynamik des ER zu koppeln. Über Interaktionen mit Kinesin-Motoren und zytoskelettalen Netzwerken trägt Kinectin zur Vesikeltraffik, zur Positionierung von Organellen und zur Aufrechterhaltung der ER-Morphologie bei – Prozesse, die die sekretorische Kapazität und die intrazelluläre Signalübertragung beeinflussen. Der KTN1-abhängige Transport und die ER-Homöostase überschneiden sich mit Signalwegen, die die Proteinfaltung und Stressantworten steuern, einschließlich der Unfolded-Protein-Response (UPR), und sind relevant für Phänotypen, die mit gestörter neuronaler Konnektivität und veränderter zellulärer Architektur einhergehen. Eine Störung der Kopplung zwischen ER und Mikrotubuli ist allgemein in Neurobiologie und Zellmigration involviert, wodurch KTN1 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Regulation des intrazellulären Transports darstellt.

Kinectin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KTN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Kinectin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KTN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KTN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Kinectin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KTN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Kinectin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Kinectin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KTN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.