IFT88 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404089-ACT

O IFT88 humano codifica um componente central do complexo B de transporte intraflagelar (IFT), necessário para a montagem, manutenção e o tráfego anterógrado ao longo dos microtúbulos axonemais do cílio primário. Ao viabilizar a importação e a renovação (turnover) de proteínas ciliares, o IFT88 sustenta vias-chave de sinalização sensorial e do desenvolvimento coordenadas no cílio, incluindo Hedgehog e outras cascatas mediadas por receptores que influenciam o controle do ciclo celular e a diferenciação. A interrupção da ciliogênese dependente de IFT88 perturba a dinâmica da sinalização ciliar e a polaridade celular, processos amplamente implicados em ciliopatias e em distúrbios relacionados que afetam a morfogênese tecidual e a homeostase. Como um nó central na biologia dos cílios, o IFT88 é frequentemente estudado para relacionar defeitos de tráfego com desregulação de vias e fenótipos como proliferação, migração ou organização epitelial alteradas.

IFT88 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IFT88 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IFT88 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IFT88 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IFT88, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IFT88. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IFT88 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IFT88 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IFT88 em células tumorais com expressão de IFT88 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.