I1PP2A Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419111-ACT

O gene murino Anp32a codifica a I1PP2A, uma fosfoproteína nuclear ácida rica em leucina que atua como inibidor e modulador da proteína fosfatase 2A (PP2A), influenciando assim redes de sinalização dependentes de fosforilação. Por meio da regulação de PP2A e de atividades associadas à cromatina, a ANP32A contribui para o controle da progressão do ciclo celular, das respostas a danos no DNA e de programas transcricionais ligados à diferenciação e à adaptação ao estresse. Ela também tem sido implicada na regulação da apoptose e, de forma mais ampla, na homeostase de RNA e proteínas, por meio de interações com complexos nucleares. A atividade desregulada de ANP32A/I1PP2A e a sinalização alterada de PP2A são relevantes para estudos de vias de quinases oncogênicas, neurobiologia e fenótipos inflamatórios ou relacionados ao estresse, nos quais o equilíbrio de fosfatases molda os desfechos celulares.

ANP32A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Anp32a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANP32A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Anp32a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Anp32a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANP32A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Anp32a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANP32A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANP32A em células tumorais com expressão de Anp32a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.