HSF4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403850-ACT

HSF4 (fattore di trascrizione dello shock termico 4) umano è un fattore di trascrizione legante il DNA che regola programmi di espressione genica responsivi allo stress, inclusi chaperoni molecolari e componenti della proteostasi che salvaguardano il ripiegamento proteico e l’omeostasi cellulare. Diversamente dagli HSF classici inducibili dal calore, HSF4 contribuisce al controllo trascrizionale associato allo sviluppo e alla differenziazione, con ruoli di rilievo nella biologia del cristallino oculare e nel mantenimento della sua trasparenza. Attraverso la modulazione di promotori contenenti elementi di risposta allo shock termico (HSE), HSF4 interseca le risposte allo stress proteotossico, il controllo qualità delle proteine e le transizioni di stato cellulare. Un’attività di HSF4 deregolata e alcune sue varianti sono state collegate ad anomalie del cristallino e a fenotipi associati alla cataratta, rendendolo rilevante per studi sull’aggregazione proteica, la differenziazione epiteliale e le reti trascrizionali specifiche di tessuto.

HSF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSF4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSF4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSF4 nelle cellule tumorali con espressione di HSF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.