HPRG CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404772-ACT

Das histidinreiche Glykoprotein (HPRG), kodiert durch das menschliche HRG-Gen, ist ein sezerniertes Plasmaprotein, das an Heparin, Plasminogen, Fibrin(ogen) und zweiwertige Metallionen bindet, um Interaktionen mit der extrazellulären Matrix sowie das proteolytische Gleichgewicht zu modulieren. Über diese Interaktionen beeinflusst HPRG die Dynamik von Gerinnung und Fibrinolyse, angiogene Signalwege und angeborene Immunprozesse, einschließlich des Verhaltens von Neutrophilen und der Beseitigung zellulärer Trümmer. Die HRG-Expression und die zirkulierenden HPRG-Spiegel wurden als Variablen untersucht, die mit entzündlichen Zuständen und der Gefäßbiologie in Zusammenhang stehen, mit Bedeutung für die Interpretation hämostase- und immunitätsassoziierter Phänotypen. Als multifunktionales, ligandenbindendes Protein wird HPRG häufig in Signalwegen untersucht, die Thromboinflammation, Matrix-Remodeling und die Signalübertragung über zelloberflächenständige Glykosaminoglykane miteinander verknüpfen.

HPRG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HRG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HPRG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HRG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HRG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HPRG-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HRG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HPRG-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HPRG-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HRG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.