HNF-6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401082-ACT

ONECUT1 kodiert den Transkriptionsfaktor HNF-6, ein Homeodomänen-Protein, das während der endodermalen Entwicklung und der epithelialen Homöostase im Erwachsenenalter gewebespezifische Genprogramme koordiniert. In humanen Zellen integriert HNF-6 Signale von Promotoren und Enhancern, um die Festlegung von Zelllinien und Differenzierungswege zu regulieren, mit ausgeprägten Funktionen in hepatischen und pankreatischen Transkriptionsnetzwerken sowie in der epithelialen Morphogenese. Durch die Modulation der Expression von Genen für Stoffwechsel, Sekretion und Zellidentität beeinflusst ONECUT1 Prozesse wie Organogenese, die Aufrechterhaltung des Zellschicksals und eine stressabhängige transkriptionelle Regulation. Eine fehlregulierte ONECUT1/HNF-6-Aktivität wurde mit veränderten Differenzierungszuständen und transkriptioneller Umprogrammierung in metabolischen und epithelialen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was seine Eignung als Knotenpunkt für mechanistische Studien genregulatorischer Schaltkreise unterstreicht.

HNF-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ONECUT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HNF-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ONECUT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ONECUT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HNF-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ONECUT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HNF-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HNF-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ONECUT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.