HERP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402787-ACT

O HERPUD1 humano codifica a proteína do retículo endoplasmático induzível por homocisteína (HERP), um componente associado à membrana do RE da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) que ajuda a manter a proteostase durante o estresse do RE. A HERP participa da degradação associada ao RE (ERAD) ao sustentar a renovação dependente de ubiquitina de proteínas mal dobradas e ao coordenar a comunicação entre a detecção de estresse e a depuração pelo proteassoma. Por meio de funções na sinalização da UPR, no equilíbrio redox e no controle de qualidade, a expressão de HERPUD1 é frequentemente usada como indicador de perturbações que afetam a capacidade de dobramento proteico e a homeostase da via secretória. A desregulação das vias de estresse do RE e ERAD está implicada em contextos como neurodegeneração, disfunção metabólica e adaptação de células tumorais, tornando o HERPUD1 um nó útil para estudos mecanísticos de resiliência ao estresse.

HERP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HERPUD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HERP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HERPUD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HERPUD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HERP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HERPUD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HERP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HERP em células tumorais com expressão de HERPUD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.