Plásmido CRISPR de Activación (h) G_{α t1}: sc-401559-ACT

GNAT1 codifica la subunidad alfa de la proteína G heterotrimérica Gαt1 (alfa de transducina), un transductor de señales clave en los fotorreceptores de bastones que acopla la rodopsina activada a enzimas efectoras en la cascada de fototransducción. Tras la estimulación lumínica, Gαt1 promueve la activación de la fosfodiesterasa para reducir los niveles de GMPc, modulando la actividad de los canales regulados por nucleótidos cíclicos y controlando la hiperpolarización de la membrana. Esta vía integra la señalización mediada por GPCR con la regulación de segundos mensajeros para sostener la sensibilidad visual y la adaptación en condiciones de baja iluminación. La desregulación o la expresión alterada de componentes de la fototransducción, incluido GNAT1, es relevante en estudios sobre disfunción retiniana hereditaria y sobre mecanismos que perturban la homeostasis de la señalización en bastones.

Gα t1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GNAT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Gα t1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GNAT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GNAT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Gα t1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GNAT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Gα t1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Gα t1 en células tumorales con expresión de GNAT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.