GSS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402992-ACT

O GSS humano codifica a glutationa sintetase, a enzima dependente de ATP que catalisa a etapa final da biossíntese de glutationa (GSH), ligando glicina à γ-glutamilcisteína. Ao controlar os reservatórios intracelulares de GSH, o GSS é central para a homeostase redox, a desintoxicação de eletrófilos por meio de vias de glutationa S-transferase e a proteção contra danos oxidativos que influenciam a função mitocondrial e a sinalização de sobrevivência celular. A atividade do GSS molda as respostas celulares às espécies reativas de oxigênio e sustenta a adaptação metabólica durante o estresse, ligando-o a processos como suscetibilidade à ferroptose, metabolismo de xenobióticos e sinalização inflamatória. O comprometimento genético ou funcional do GSS está associado à deficiência de glutationa e a fenótipos de estresse oxidativo, fornecendo uma conexão mecanística com disfunção hematológica e neurológica e com a biologia de doenças mais amplas relacionadas ao redox.

GSS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GSS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GSS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GSS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GSS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GSS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GSS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GSS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GSS em células tumorais com expressão de GSS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.