Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRB14: sc-405224-ACT

GRB14 (growth factor receptor-bound protein 14) est une protéine adaptatrice qui se lie aux récepteurs tyrosine kinases activés et module la transduction des signaux en aval, avec des interactions bien caractérisées affectant la signalisation du récepteur de l’insuline et d’IGF1R. En s’associant à des complexes de signalisation à la membrane plasmique, GRB14 peut influencer l’activité des voies PI3K–AKT et MAPK, façonnant les programmes cellulaires de métabolisme, de prolifération et de survie. Des altérations de l’expression ou de l’activité de GRB14 ont été associées à une dérégulation de la signalisation de l’insuline et à des phénotypes métaboliques, et sa position dans ces voies la rend également pertinente pour les états cellulaires dépendants des facteurs de croissance étudiés en biologie du cancer. La modulation expérimentale de GRB14 soutient des travaux mécanistiques sur la signalisation proximale aux récepteurs, le contrôle par rétroaction et le dialogue entre voies dans des modèles de cellules humaines.

GRB14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRB14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRB14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRB14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRB14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRB14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRB14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRB14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRB14 dans les cellules tumorales présentant une expression de GRB14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.