Plasmide CRISPR d'Activation (m) GLI-2: sc-420576-ACT

Le gène murin *Gli2* code GLI-2, un facteur de transcription à doigts de zinc qui constitue un effecteur majeur en aval de la signalisation Hedgehog. Après l’activation de la voie, GLI-2 régule des programmes transcriptionnels qui contrôlent la mise en place des patrons embryonnaires, le maintien des cellules souches/progénitrices et la spécification des lignages, en intégrant des signaux qui influencent la prolifération et la différenciation. Une activité dérégulée de GLI-2 est associée à des processus développementaux aberrants et a été largement impliquée dans la biologie tumorale liée à la voie Hedgehog ainsi que dans des contextes de remodelage tissulaire. En tant que régulateur transcriptionnel sensible à cette voie, GLI-2 est fréquemment utilisé dans des modèles murins pour étudier les réseaux de gènes gouvernés par des morphogènes, les dépendances à la signalisation ciliaire et le contrôle transcriptionnel des décisions de destin cellulaire.

GLI-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gli2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GLI-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gli2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gli2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GLI-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gli2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GLI-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GLI-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Gli2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.