gankyrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402164-ACT

PSMD10 kodiert Gankyrin, ein Ankyrin-Repeat-haltiges Onkoprotein, das mit dem regulatorischen Komplex des 26S-Proteasoms assoziiert ist und den ubiquitinabhängigen Proteinumsatz moduliert. Durch die Interaktion mit zentralen Tumorsuppressor-Signalwegen, darunter RB1/E2F- und p53-Signaling, beeinflusst Gankyrin die Zellzyklusprogression, die Checkpoint-Kontrolle und die Apoptose. Eine aberrante PSMD10-Expression wurde in mehreren Krebskontexten mit dysregulierter Proliferation und veränderter Proteostase in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle sowie von Netzwerken der Proteindegradation stützt. Darüber hinaus beeinflusst Gankyrin Stressantwort- und Entzündungssignale durch Effekte auf Proteinstabilität und den Zusammenbau regulatorischer Komplexe.

gankyrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSMD10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

gankyrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSMD10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSMD10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen gankyrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSMD10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von gankyrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des gankyrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSMD10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.