GADD 45β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401286-ACT

GADD45B (GADD45β) é um membro induzível por estresse da família de genes induzíveis por parada de crescimento e dano ao DNA (GADD45) que integra sinais genotóxicos, inflamatórios e metabólicos para modular decisões sobre o destino celular. Participa da resposta ao dano ao DNA e de vias de sinalização associadas ao reparo, interage com as vias de MAPK (incluindo JNK e p38) e com programas regulados por NF-κB, e pode influenciar o controle do ciclo celular, a apoptose e a adaptação celular ao estresse. Em células humanas, a expressão desregulada de GADD45β tem sido associada a alterações na sinalização de estresse e nas respostas transcricionais observadas em múltiplos contextos de doença, incluindo a biologia do câncer e patologias associadas ao sistema imune. Essas características tornam o GADD45β um nó molecular útil para dissecar o crosstalk entre a sinalização de dano ao DNA, a inflamação e programas de sobrevivência.

GADD 45β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GADD45B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GADD 45β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GADD45B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GADD45B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GADD 45β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GADD45B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GADD 45β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GADD 45β em células tumorais com expressão de GADD45B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.