GABA_A Rε Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405545-ACT

GABRE codifica a subunidade ε do receptor humano GABA\_A, um canal de cloreto ativado por ligante que medeia a neurotransmissão inibitória rápida no sistema nervoso central. A incorporação da subunidade ε pode alterar o gating do receptor, a farmacologia e a cinética de dessensibilização, moldando a excitabilidade neuronal e a inibição sináptica. A sinalização do receptor GABA\_A é um componente central das vias de canais iónicos regulados por neurotransmissores que controlam o potencial de membrana, as oscilações de rede e a plasticidade dependente da atividade. A desregulação do tónus GABAérgico e alterações na composição de subunidades do receptor têm sido associadas a fenótipos neuropsiquiátricos e relacionados com crises convulsivas, o que motiva estudos mecanísticos da função específica de subunidades.

GABAA Rε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GABRE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GABAA Rε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GABRE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GABRE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GABAA Rε. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GABRE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GABAA Rε no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GABAA Rε em células tumorais com expressão de GABRE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.