GABA_A Rα3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403044-ACT

GABRA3 codifica a subunidade alfa 3 do recetor humano de ácido γ-aminobutírico do tipo A (GABAARα3), um componente de um canal de cloreto ativado por ligando que medeia a neurotransmissão inibitória rápida. A incorporação da subunidade α3 em recetores GABAA pentaméricos influencia a abertura/fecho do canal, a farmacologia e o balanço entre a inibição sináptica e extrasináptica, afetando a excitabilidade neuronal e as oscilações das redes neuronais. O GABAARα3 participa na função das sinapses GABAérgicas e em processos neurodesenvolvimentais mais amplos, incluindo o crescimento de neuritos e a maturação de circuitos, através de sinalização dependente da atividade. Alterações na expressão de GABRA3 ou desequilíbrios na sinalização inibitória têm sido associadas, em estudos de investigação, a fenótipos neurológicos e a estados relevantes para doença, nos quais a perturbação do equilíbrio entre excitação e inibição contribui para a fisiopatologia.

GABAA Rα3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GABRA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GABAA Rα3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GABRA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GABRA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GABAA Rα3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GABRA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GABAA Rα3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GABAA Rα3 em células tumorais com expressão de GABRA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.