FucT-VIII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402957-ACT

FUT8 codifica l’alfa-(1,6)-fucosiltransferasi (FucT-VIII), l’enzima residente nel Golgi che catalizza la fucosilazione del core dei glicani N-legati sulle glicoproteine. Questa modifica influenza il ripiegamento proteico, la secrezione, le interazioni recettore–ligando e la segnalazione a valle in diversi circuiti regolati dallo stato di glicosilazione, incluse le reti dei fattori di crescita e dei recettori immunitari. Un’attività alterata di FUT8 è associata a cambiamenti nell’adesione e nella migrazione cellulare ed è stata collegata al rimodellamento disfunzionale delle glicoproteine osservato nella biologia del cancro, nell’infiammazione e nei disordini congeniti della glicosilazione. Di conseguenza, FUT8 è ampiamente studiato nella glicobiologia, nel controllo qualità delle proteine secrete e nei meccanismi che collegano la processazione dei glicani nel Golgi alla trasduzione del segnale.

FucT-VIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FUT8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FucT-VIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FUT8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FUT8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FucT-VIII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FUT8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FucT-VIII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FucT-VIII nelle cellule tumorali con espressione di FUT8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.