FRP-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402504-ACT

O FRZB humano codifica a proteína 3 relacionada a frizzled (FRP-3), um antagonista secretado de ligantes Wnt que modula a ativação do receptor Frizzled e a transcrição a jusante dependente de β-catenina. Ao moldar gradientes de Wnt, a FRP-3 influencia decisões de destino celular, proliferação e a homeostase da matriz extracelular durante o desenvolvimento e em tecidos adultos, incluindo cartilagem e tecido conjuntivo. Alterações na expressão ou na função de FRZB têm sido associadas à desregulação da sinalização Wnt na biologia musculoesquelética e em vias associadas a tumores, tornando-o relevante para estudos de osteoartrite, desenvolvimento esquelético e comportamento de células cancerosas. A atividade da FRP-3 também se cruza com o crosstalk BMP/TGF-β e com programas de remodelação da matriz que impactam a organização e a diferenciação tecidual.

FRP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FRZB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FRP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FRZB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FRZB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FRP-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FRZB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FRP-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FRP-3 em células tumorais com expressão de FRZB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.