Fibulin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401754-ACT

FBLN1 kodiert Fibulin-1, ein sezerniertes Glykoprotein der extrazellulären Matrix (EZM), das mit elastischen Fasern und Komponenten der Basalmembran assoziiert und so den Aufbau der Matrix, die Zelladhäsion und das Gewebe-Remodeling reguliert. Fibulin-1 interagiert mit Integrinen und anderen EZM-Proteinen und beeinflusst dadurch die Organisation des Zytoskeletts, die Zellmigration und die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren, wodurch es mit der Signalübertragung über EZM–Rezeptor-Interaktionen und der Mechanotransduktion verknüpft ist. Veränderte FBLN1-Expression und Fibulin-1-Ablagerung wurden im Kontext vaskulären Remodelings, von Fibrose und tumorassoziierten stromalen Veränderungen beobachtet, was es für Studien zu mikroenvironmentgetriebenen Phänotypen relevant macht. In humanen Zellmodellen wird FBLN1 häufig hinsichtlich seines Beitrags zu epithelial-mesenchymalen Interaktionen, zur Endothelfunktion sowie zur matrixabhängigen Regulation von Proliferation und Motilität untersucht.

Fibulin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FBLN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibulin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FBLN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FBLN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibulin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FBLN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibulin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibulin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FBLN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.