Fibronectin Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h): sc-400082

Visão geral

FN1 codifica a fibronectina, uma grande glicoproteína da matriz extracelular que medeia a adesão celular, a migração e a mecanotransdução ao ligar-se a integrinas e a múltiplos componentes da matriz, incluindo colagénio e proteoglicanos de sulfato de heparano. A fibrilogénese da fibronectina molda a arquitetura da matriz extracelular e influencia a dinâmica do citoesqueleto por meio de vias de sinalização das adesões focais, como FAK/SRC, e da regulação subsequente de GTPases Rho. O FN1 também está envolvido na reparação de feridas, nas interações epitélio–mesênquima e na remodelação vascular, integrando sinais que controlam a proliferação e a diferenciação. A deposição e a sinalização desreguladas de fibronectina estão associadas à fibrose, à remodelação do estroma associada a tumores e a microambientes inflamatórios, tornando o FN1 um nó-chave para o estudo de mecanismos de doença impulsionados pela matriz extracelular.

O Fibronectin CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene FN1 em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus FN1, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o Fibronectin Plasmídeo HDR (h) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido FN1.
Quando co-transfectado com o Fibronectin Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto FN1.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus FN1 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) FN1 crítico(s) para a função Fibronectin
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.