Fibronectin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420394-ACT

Fn1 codifica la fibronectina, una glicoproteina della matrice extracellulare ad alto peso molecolare che coordina l’adesione cellulare, la migrazione e l’organizzazione del citoscheletro attraverso il legame con le integrine e con molteplici componenti della matrice. La segnalazione della fibronectina interagisce con la dinamica delle adesioni focali, il rimodellamento dell’actina e la disponibilità dei fattori di crescita, influenzando processi quali la riparazione delle ferite, l’angiogenesi e le transizioni epitelio-mesenchimali. Nei modelli murini, un’espressione alterata di Fn1 o l’assemblaggio della matrice sono frequentemente associati a fibrosi tissutale, interazioni tumore–stroma e rimodellamento infiammatorio, rendendola un nodo chiave per studiare la regolazione della matrice extracellulare in microambienti rilevanti per la malattia.

Fibronectin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fn1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibronectin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fn1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fn1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibronectin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fn1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibronectin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibronectin nelle cellule tumorali con espressione di Fn1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.