Plásmido CRISPR de Activación (h) fibrillin-1: sc-401449-ACT

FBN1 codifica la fibrilina-1, una gran glicoproteína de la matriz extracelular que se ensambla en microfibrillas y aporta soporte estructural y elasticidad a los tejidos conjuntivos. La fibrilina-1 sirve de andamiaje para la formación de fibras elásticas y regula la biodisponibilidad de factores de crecimiento, en particular la señalización de TGF-β y BMP, al secuestrar complejos latentes dentro de la matriz. A través de estas funciones, influye en la mecanotransducción, las interacciones célula–matriz y la homeostasis tisular en el sistema vascular, el pulmón, la piel y el sistema musculoesquelético. La alteración de la expresión de FBN1 o de la integridad de las microfibrillas se asocia con trastornos hereditarios del tejido conectivo y con una actividad desregulada de la vía de TGF-β, relevante para fenotipos cardiovasculares y esqueléticos.

fibrillin-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FBN1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

fibrillin-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FBN1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FBN1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de fibrillin-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FBN1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de fibrillin-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía fibrillin-1 en células tumorales con expresión de FBN1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.