Plásmido CRISPR de Activación (h) EPHX2: sc-402095-ACT

EPHX2 codifica la epóxido hidrolasa soluble (sEH), una enzima bifuncional que convierte epoxiácidos grasos bioactivos como los ácidos epoxieicosatrienoicos (EET) en dioles menos activos, modulando el tono de mediadores lipídicos en contextos vasculares, renales e inmunitarios. A través de este papel en el metabolismo del ácido araquidónico y, de forma más amplia, de los oxilipinos, EPHX2 influye en redes de señalización vinculadas a la resolución de la inflamación, la función endotelial, las respuestas al estrés oxidativo y la regulación de la presión arterial. Las alteraciones en la actividad de la sEH y en los patrones de expresión de EPHX2 se han asociado con rasgos cardiometabólicos, vías relacionadas con la hipertensión y mecanismos de enfermedades inflamatorias, lo que ha impulsado estudios mecanísticos sobre el recambio de epóxidos lipídicos. En modelos celulares, la modulación de EPHX2 se utiliza para explorar la interrelación entre la señalización lipídica, los programas de citocinas y las respuestas transcripcionales activadas por el estrés.

sEH El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EPHX2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

sEH El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EPHX2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EPHX2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de sEH. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EPHX2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de sEH en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía sEH en células tumorales con expresión de EPHX2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.