ephrin-A5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420123-ACT

Efna5 codifica a efrina-A5, um ligante ancorado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) para recetores EphA, que medeia sinalização celular dependente de contacto, controlando a orientação axonal, a migração neuronal e a organização sináptica. A sinalização “forward” e “reverse” efrina-A5–Eph coordena a remodelação do citoesqueleto através de GTPases da família Rho e cruza-se com vias associadas a MAPK/ERK e PI3K para regular adesão, repulsão e a formação de limites tecidulares. Em sistemas murinos, a atividade de Efna5 é amplamente utilizada para modelar mecanismos de montagem de circuitos neurais, mapeamento retiniano e padronização do desenvolvimento. A desregulação da sinalização efrina/Eph está implicada em fenótipos do neurodesenvolvimento e em programas aberrantes de motilidade celular relevantes para a biologia do cancro e para contextos de investigação em angiogénese.

ephrin-A5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Efna5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ephrin-A5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Efna5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Efna5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ephrin-A5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Efna5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ephrin-A5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ephrin-A5 em células tumorais com expressão de Efna5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.