Plásmido CRISPR de Activación (h) EDD: sc-402123-ACT

UBR5 codifica la proteína humana EDD, una ligasa E3 de ubiquitina de tipo HECT que regula el recambio proteico y la señalización mediante ubiquitinación dirigida. EDD participa en programas de estabilidad genómica al coordinar la detección y la reparación del daño en el ADN, modular el control de los puntos de control (checkpoints) y moldear las respuestas transcripcionales al estrés celular. A través de estas funciones, influye en la progresión del ciclo celular, la tolerancia al estrés replicativo y las vías de proteostasis que convergen con la dinámica del sistema ubiquitina–proteasoma. La actividad desregulada de UBR5/EDD y las variaciones en el número de copias se han asociado con redes de señalización oncogénica alteradas y una capacidad de reparación del ADN aberrante, lo que respalda su uso como nodo mecanístico en estudios de biología tumoral y de transcripción adaptativa al estrés.

EDD El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UBR5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

EDD El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UBR5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UBR5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de EDD. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UBR5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de EDD en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía EDD en células tumorales con expresión de UBR5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.