DZIP3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403972-ACT

O DZIP3 humano codifica uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING, implicada na degradação de proteínas dependente de ubiquitina e na regulação da transdução de sinais na interface entre a membrana celular e o citoesqueleto. Por meio da ubiquitinação seletiva de substratos, o DZIP3 pode influenciar a proteostase, o tráfego intracelular e transições de estado celular que dependem de uma remodelação coordenada de complexos proteicos. A desregulação de componentes da via ubiquitina–proteassoma, incluindo ligases E3, é frequentemente associada a programas alterados de proliferação, diferenciação e resposta ao estresse, relevantes para pesquisas em câncer e neurobiologia. Assim, o DZIP3 é de interesse para dissecar o controle mediado por ubiquitina sobre os desfechos transcricionais e a responsividade de vias de sinalização em modelos de células humanas.

DZIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DZIP3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DZIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DZIP3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DZIP3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DZIP3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DZIP3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DZIP3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DZIP3 em células tumorais com expressão de DZIP3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.