DLK1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420009-ACT

Delta-like non-canonical Notch ligand 1 (Dlk1/DLK1) è una proteina transmembrana soggetta a imprinting, regolata durante lo sviluppo, che può essere processata proteoliticamente in una forma solubile e funziona come modulatore della segnalazione cellula-cellula. Nei tessuti murini, Dlk1 è strettamente associata al controllo dell’impegno di linea e del rimodellamento tissutale in contesti mesenchimali e neuroendocrini, influenzando i programmi di differenziamento adipogenico e osteogenico e contribuendo al mantenimento di cellule staminali/progenitrici. DLK1 interseca output di segnalazione correlati a Notch e associati a MAPK/ERK ed è comunemente studiata nell’ambito della regolazione più ampia delle reti di geni imprintati e delle vie di sviluppo endocrino. Un’espressione deregolata di Dlk1 è stata associata a fenotipi di crescita e differenziamento alterati ed è spesso esaminata in modelli di disfunzione metabolica, fibrosi e anomalie dello sviluppo.

DLK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dlk1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DLK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dlk1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dlk1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DLK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dlk1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DLK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DLK1 nelle cellule tumorali con espressione di Dlk1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.