DEC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402891-ACT

BHLHE41 codifica o fator de transcrição básico hélice-alça-hélice DEC2, um regulador nuclear que se liga a motivos E-box para modular redes transcricionais circadianas e programas de estado celular. O DEC2 integra sinais de componentes centrais do relógio biológico e acopla a expressão gênica rítmica a processos como o timing do ciclo sono–vigília, a adaptação metabólica e respostas celulares ao estresse, incluindo o remodelamento transcricional associado à hipóxia. Em contextos imunes e epiteliais, o DEC2 tem sido relacionado à diferenciação e à sinalização inflamatória ao moldar as saídas transcricionais a jusante de estímulos ambientais. Atividade desregulada de BHLHE41/DEC2 tem sido associada na literatura a fenótipos de sono alterados e a funções dependentes do contexto na biologia tumoral e em modelos de doenças metabólicas, sustentando estudos mecanísticos de controle transcricional.

DEC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BHLHE41 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DEC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BHLHE41 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BHLHE41, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DEC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BHLHE41 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DEC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DEC2 em células tumorais com expressão de BHLHE41 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.