DANGER Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407681-ACT

ITPRIP codifica DANGER (ITPRIP), um regulador enriquecido em neurónios que se associa à sinalização do recetor de inositol 1,4,5-trifosfato e pode influenciar a dinâmica intracelular de Ca2+ ligada à libertação de cálcio do RE. Foi relatado que DANGER modula vias responsivas ao stress e a sinalização relacionada com a apoptose, incluindo interações ligadas à regulação de caspases, moldando assim decisões de sobrevivência celular sob condições excitotóxicas ou proteotóxicas. Através do seu acoplamento a redes de sinalização dependentes de cálcio, DANGER é relevante para estudos de função sináptica, respostas ao stress mitocondrial e programas transcricionais a jusante. A homeostase do cálcio desregulada e a sinalização alterada associada a DANGER têm sido implicadas em mecanismos pertinentes para a neurodegeneração e para modelos de lesão neuronal.

DANGER O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITPRIP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DANGER O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITPRIP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITPRIP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DANGER. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITPRIP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DANGER no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DANGER em células tumorais com expressão de ITPRIP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.