D4DR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402947-ACT

O DRD4 humano codifica o receptor de dopamina D4 (D4DR), um GPCR acoplado a Gi/o que modula a atividade da adenilato ciclase, a sinalização de cAMP/PKA e programas de fosforilação a jusante que moldam a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica. O D4DR também aciona vias ligadas a MAPK e à β-arrestina, influenciando a dessensibilização do receptor, o tráfego intracelular e respostas transcricionais de mais longo prazo ao tônus dopaminérgico. A expressão do DRD4 e a variação regulatória têm sido investigadas no contexto da função de circuitos frontoestriatais e de fenótipos neuropsiquiátricos, tornando-o um nó molecular útil para estudar a dinâmica da sinalização dopaminérgica. Em modelos celulares, a perturbação de DRD4 pode ser usada para investigar o acoplamento de vias, a farmacologia do receptor e respostas transcricionais à dopamina em sistemas neurais relevantes e em sistemas heterólogos de expressão.

D4DR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DRD4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

D4DR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DRD4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DRD4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de D4DR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DRD4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de D4DR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via D4DR em células tumorais com expressão de DRD4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.