Cytokeratin 6A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401650-ACT

KRT6A codifica a citoqueratina 6A, uma proteína de filamento intermédio do tipo II que forma heterodímeros com queratinas do tipo I para construir o citoesqueleto de queratina em epitélios estratificados. Ela sustenta a integridade mecânica do epitélio, as respostas celulares ao stress e a ativação de queratinócitos associada a feridas, integrando-se com programas de remodelação do citoesqueleto que influenciam a adesão, a migração e a diferenciação. A expressão da citoqueratina 6A é regulada de forma dinâmica durante estados de hiperproliferação e reparação tecidular, e alterações na atividade de KRT6A têm sido associadas a fenótipos de queratinização e disfunção da barreira epitelial. Estas propriedades fazem de KRT6A um nó útil para estudar a homeostase epidérmica, a montagem da rede de queratinas e vias de adaptação ao stress em epitélios.

Cytokeratin 6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT6A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT6A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT6A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 6A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT6A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 6A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 6A em células tumorais com expressão de KRT6A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.