Cytokeratin 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401893-ACT

KRT4 codifica a citoqueratina 4, uma proteína de filamento intermediário do tipo II que forma heterodímeros com queratinas do tipo I para construir a rede de filamentos de queratina em epitélios estratificados não queratinizados, incluindo a mucosa oral e esofágica. Esse arcabouço citoesquelético sustenta a integridade mecânica do epitélio, a organização das junções célula–célula e programas de diferenciação coordenados com a renovação das queratinas, a proteostase e a sinalização responsiva ao estresse. Alterações na expressão de KRT4 ou na montagem dos filamentos podem comprometer a função de barreira do epitélio e a arquitetura tecidual, o que a torna relevante para estudos de homeostase mucosa, remodelamento associado à irritação e displasia epitelial. Como um gene estrutural ligado à diferenciação, KRT4 é frequentemente usado como leitura molecular em rastreamento de linhagem epitelial e em análises de regulação transcricional.

Cytokeratin 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 4 em células tumorais com expressão de KRT4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.