Cytokeratin 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400893-ACT

KRT1 codifica a citoqueratina 1, uma proteína de filamento intermédio do tipo II que forma heterodímeros com a queratina 10 para constituir a rede de queratinas suprabasais em epitélios estratificados. Este sistema de filamentos confere resistência mecânica, sustenta a adesão célula–célula associada a desmossomas e participa nos programas de diferenciação dos queratinócitos e de formação da barreira. A dinâmica da citoqueratina 1 interage com a remodelação do citoesqueleto e com a sinalização de resposta ao stress, influenciando a integridade epitelial durante a reparação de feridas e a inflamação. A expressão desregulada de KRT1 ou a organização anómala dos filamentos de queratina está associada a fenótipos de fragilidade epidérmica e é frequentemente investigada em estudos sobre hiperqueratose, defeitos de queratinização e adaptação do epitélio ao stress.

Cytokeratin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 1 em células tumorais com expressão de KRT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.