CYPOR CRISPR Activationプラスミド (m): sc-422345-ACT

マウスのPorは、シトクロムP450オキシドレダクターゼ（CYPOR）をコードしている。CYPORは小胞体（ER）膜に局在するフラボタンパク質で、NADPHからミクロソーム型シトクロムP450酵素やその他の酸化還元パートナーへ電子を受け渡す。P450の触媒サイクルを可能にすることで、CYPORは内因性脂質やステロイドの酸化代謝に加え、外来性化合物（ゼノバイオティクス）の生体内変換も支え、Por活性は肝臓の解毒、レドックス恒常性、ならびにER関連代謝ネットワークと結び付く。CYPOR機能の変化はP450依存性経路を撹乱し、活性酸素種（ROS）のバランスを変化させ得るため、Porは代謝ストレスや薬理学関連表現型のモデルにおける重要な変数となる。生物医学研究では、Porは基質特異的な影響からP450の電子伝達要件を切り分けたり、組織横断的に遺伝子型と代謝物の関係をマッピングしたりする目的で、しばしば解析対象とされる。

CYPOR CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Porの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CYPOR CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Por 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPor転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CYPORの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPor遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCYPOR依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPor発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCYPOR経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。