CYP3A4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-416463-ACT-2

O gene humano CYP3A4 codifica uma importante monooxigenase do citocromo P450, localizada principalmente no retículo endoplasmático, que catalisa o metabolismo oxidativo de diversos xenobióticos e substratos endógenos, incluindo esteroides e intermediários de ácidos biliares. Sua expressão e atividade são reguladas por vias de sinalização de receptores nucleares, como PXR (NR1I2) e CAR (NR1I3), conectando o CYP3A4 a programas hepáticos de desintoxicação, à homeostase redox e a mecanismos de interações fármaco–fármaco. A variabilidade interindividual, impulsionada por polimorfismos genéticos e por transcrição induzível, contribui para alterações na capacidade metabólica e tem sido associada, em estudos farmacogenômicos, à suscetibilidade a reações adversas a medicamentos e a fenótipos relacionados ao fígado. A edição gênica do CYP3A4 permite a construção de modelos celulares isogênicos para investigar a função enzimática, elementos regulatórios e respostas de redes metabólicas, além de quantificar impactos na depuração de xenobióticos e no metabolismo de esteroides em sistemas relevantes para humanos.

CYP3A4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYP3A4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CYP3A4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYP3A4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYP3A4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CYP3A4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYP3A4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CYP3A4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CYP3A4 em células tumorais com expressão de CYP3A4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.