cyclin E Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400105-ACT

O CCNE1 humano codifica a ciclina E, um regulador central da transição G1/S que forma um complexo quinase ativo com a CDK2 para promover o licenciamento das origens de replicação do DNA e a entrada na fase S. A sinalização ciclina E–CDK2 integra estímulos mitogênicos ao controle de checkpoints ao coordenar a fosforilação de substratos envolvidos na transcrição dependente de E2F, no timing de replicação e na duplicação do centrossomo. A expressão desregulada de CCNE1 compromete a fidelidade do ciclo celular e a estabilidade do genoma, associando a atividade da ciclina E ao estresse de replicação, à instabilidade cromossômica e à proliferação celular oncogênica. Consequentemente, o CCNE1 é amplamente estudado em vias que regulam a progressão do ciclo celular, as respostas a danos no DNA e os mecanismos de controle do crescimento celular em sistemas-modelo humanos.

cyclin E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCNE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cyclin E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCNE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCNE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cyclin E. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCNE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cyclin E no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cyclin E em células tumorais com expressão de CCNE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.