cyclin D2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401236-ACT

CCND2 kodiert Cyclin D2, ein zentrales G1-Phasen-Cyclin, das an CDK4/6 bindet und diese aktiviert, um die Phosphorylierung von RB-Proteinen zu fördern und E2F-Transkriptionsprogramme freizusetzen, die für den Eintritt in die S‑Phase erforderlich sind. Durch die Integration mitogener Signale aus Signalwegen wie PI3K–AKT, MAPK/ERK und wachstumsfaktorresponsiven Transkriptionsnetzwerken trägt Cyclin D2 zur Regulation von Proliferation, Zellzyklus-Festlegung (Commitment) und gewebespezifischer Expansion in mehreren Geweben bei. Eine fehlregulierte CCND2-Expression oder Kopienzahl kann die Checkpoint-Kontrolle und Zellschicksalsentscheidungen stören und ist daher relevant für Studien zur onkogenen Umgestaltung des Zellzyklus, zu Entwicklungs-Überwuchsphänotypen sowie zu kontextabhängigen Differenzierungsdefekten. Da Cyclin D2 mit der CDK4/6-Aktivität und der RB–E2F-Signalgebung verknüpft ist, wird es häufig als mechanistischer Knotenpunkt genutzt, um proliferationsabhängige Transkription und metabolische Reprogrammierung zu untersuchen.

cyclin D2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCND2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cyclin D2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCND2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCND2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cyclin D2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCND2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cyclin D2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cyclin D2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCND2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.