Plasmide CRISPR d'Activation (h) CstF-77: sc-404038-ACT

CSTF3 code pour la sous-unité de 77 kDa du facteur de stimulation du clivage (CstF‑77), un composant central de la machinerie de maturation de l’extrémité 3′ des pré‑ARNm, qui couple le clivage et la polyadénylation à la terminaison de la transcription. En coordonnant la reconnaissance des signaux poly(A) avec d’autres facteurs de clivage et de polyadénylation (CPA), CstF‑77 contribue à moduler la stabilité des transcrits, leur export nucléaire et la production protéique via la polyadénylation alternative et le contrôle de la longueur de la région 3′ UTR. Des perturbations de la quantité ou de l’activité des facteurs CPA peuvent modifier la sélection globale des sites poly(A) et reprogrammer des réseaux d’expression génique qui gouvernent la prolifération, la différenciation et les réponses au stress. En conséquence, CSTF3 est souvent étudié dans le contexte d’une dérégulation de la maturation des ARN et de ses associations avec des états transcriptionnels oncogéniques et, plus largement, avec des anomalies de l’expression génique.

CstF-77 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CSTF3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CstF-77 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CSTF3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CSTF3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CstF-77. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CSTF3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CstF-77 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CstF-77 dans les cellules tumorales présentant une expression de CSTF3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.